傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡細(xì)胞化學(xué)原理

顯微鏡細(xì)胞化學(xué)是利用特異的化學(xué)或生化反應(yīng)在顯微鏡下對(duì)細(xì)胞的化學(xué)成份進(jìn)行定性與定位分析的方法.顯微鏡細(xì)胞化學(xué)是在光鏡細(xì)胞化學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。所不同的是，偏光顯微鏡細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)的結(jié)果必須在所研究的化學(xué)成份的部位引起顯微子密度的改變，這是由顯微鏡的成像原理所決定的。顯微鏡價(jià)格根據(jù)造成細(xì)胞中顯微子密度變化的原因、可將顯微鏡細(xì)胞化學(xué)方法分為三類(lèi):

1.反應(yīng)產(chǎn)物是不溶解的并且是高顯微子密度的。數(shù)碼顯微鏡在固定劑中加入草酸鈉，能將細(xì)胞內(nèi)的鈣離子變?yōu)椴菟徕}沉5.2顯微鏡細(xì)胞化學(xué)樣品制備的一般過(guò)程顯微鏡細(xì)胞化學(xué)樣品制備包括以下主要步驟:(1)醛類(lèi)固定;2)厚切片制備;(3)顯微鏡孵育;(4)餓酸后固定;(5)常規(guī)脫水、包埋、切片

顯微鏡孵育一步中孵育液的成份及孵育的條件隨所研究的酶而有所不同，將在后面結(jié)合具體方法討論。這里僅就(1), (2)兩步作一點(diǎn)簡(jiǎn)要說(shuō)明。為兼顧結(jié)構(gòu)和酶活性的保存，顯微鏡細(xì)胞化學(xué)中多使用甲醛(由多聚甲醛制備)和戊二醛的混合固定劑，其具體濃度因所研究的酶而異，需要注意的是，市售戊二醛中含有雜質(zhì)，用于顯微鏡細(xì)胞化學(xué)固定時(shí)應(yīng)當(dāng)純化。純化方法有真空燕餾，活性碳過(guò)濾，離子交換，Sephadex G-10分離等。也可使用市場(chǎng)上出售的專(zhuān)用于顯微鏡細(xì)胞化學(xué)的純化戊二醛，這種戊二醛裝于安瓶?jī)?nèi)，處于無(wú)氧條件下。樣品于固定之后應(yīng)制備成厚度約405m的切片，再進(jìn)入孵育液，而不宜用組織塊。這是因?yàn)榻M織塊較大，孵育液成份不易浸透至其中心。而且各種孵育液成份擴(kuò)散速度不同，由此可能導(dǎo)至組織中心部位的人工假象(反應(yīng)產(chǎn)物的擴(kuò)散和假陽(yáng)性)。制備厚切片可使用振動(dòng)切片機(jī)或微切片機(jī)(Microslicer )。下面介紹幾種酶的顯微鏡細(xì)胞化學(xué)方法。淀下來(lái)，并在顯微鏡下顯示為高顯微子密度。

2.顯微鏡反應(yīng)產(chǎn)物是不溶解的，經(jīng)過(guò)顯微鏡樣品制備中的常規(guī)鍬酸固定可變?yōu)楦唢@微子密度的.例如DAB可被細(xì)胞色素氧化酶所氧化而形成沉淀，并可被俄化，用于顯示酶所在部位。

3。反應(yīng)產(chǎn)物本身是可溶性的，需要在孵育液內(nèi)加入俘獲劑而使其沉淀并賦于其高顯微子密度，多數(shù)顯示酶的顯微鏡細(xì)胞化學(xué)方法屬于此類(lèi)。